γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）試劑盒說明書

                                                 微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

測定原理：

在ATP和Mg²⁺存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時ATP去磷酸化產(chǎn)生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。

自備儀器和用品：

冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體105mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。

試劑四：液體7mL×1瓶，室溫保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入400µL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.        血清等液體：直接測定。

GCL測定操作：

1.        分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到660nm，蒸餾水調(diào)零。

2.        空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應(yīng)15 min；再加入試劑四60µL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A空白管。

3.        測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應(yīng)15 min；再加入試劑四60µL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，

4.        取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A測定管。

注意：空白管只需要測定一次。

GCL活性計算公式：

標準曲線：y=0.1427x，R²=0.9987

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=3.815×（A測定管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCL（μg/min /g 鮮重）= [（A測定管-A空白管）÷0.1427×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃下，每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /10⁴ cell）=[（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 3.815×（A測定管-A空白管）÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mL）=  [（A測定管-A空白管）÷ 0.1427×V反總]÷V樣÷T

=  3.815×（A測定管-A空白管）

0.1427：回歸方程系數(shù)；V反總：反應(yīng)總體積（mL）196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，24µL =2.4×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：15min。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.07135x，R²=0.9987

（(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mg prot）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(Cpr×V樣)÷T

=7.63×（A測定管-A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為為1個酶活單位。

GCL（μg/min /g 鮮重）=  [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 7.63×（A測定管-A空白管）÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃下，每10⁴個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /10⁴ cell）=[（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

= 7.63×（A測定管-A空白管）÷細胞數(shù)量

（4）按照液體體積計算

活性單位定義：37℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生1μg無機磷的GCL酶活量為1個酶活單位。

GCL（μg/min /mL）= [（A測定管-A空白管）÷0.07135×V反總]÷V樣÷T

=7.63×（A測定管-A空白管）

0.07135：回歸方程系數(shù)；V反總：反應(yīng)總體積（mL）196 µL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，24µL =2.4×10^-2 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間：15min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，以免影響其活力。如果是勻漿液，避免反復(fù)凍融。

（2）所有試劑配制完后，除表明4℃保存外，請于1天內(nèi)用完。

（3）實驗過程請帶手套，試劑三中有強腐蝕性物質(zhì)，注意不要濺到皮膚上或眼睛內(nèi)。

（4）測定吸光值時請于水浴后10～40分鐘內(nèi)測完。

（5）樣本測定前先取1-2個樣做預(yù)實驗，如吸光值太高，應(yīng)先用試劑一(或者生理鹽水)稀釋到適當倍數(shù)，使得吸光值在標準曲線范圍內(nèi)，哺乳動物組織和血液一般稀釋3～5倍。

（6）試劑三配制過程中，可能會產(chǎn)生黑色固體，其不影響結(jié)果，注意吸取時不要將黑色固體吸入。

（7）細胞中GCL活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中GCL的提取時可加試劑一（或生理鹽水）后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞